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Empaquetado del ADN en cromosomas. Cromosoma y cromatina. Empaquetado de material genético en un cromosoma.

Introducción

Las moléculas de ADN en las células eucariotas son muy grandes. Así, la longitud de las moléculas de ADN aisladas de células humanas alcanza varios centímetros. Generalmente se acepta que cada cromosoma eucariota contiene una única molécula de ADN continua. Teniendo en cuenta el número de especies de cromosomas en los mamíferos, podemos decir que en promedio tienen alrededor de 2 m de ADN por núcleo en interfase, ubicado en un núcleo esférico con un diámetro inferior a 10 μm. Al mismo tiempo, se debe mantener un cierto orden de disposición de las moléculas de ADN en el núcleo para asegurar su funcionamiento ordenado.

Es por eso que las moléculas de ADN en los núcleos de las células eucariotas siempre están en complejo con proteínas como parte de la cromatina, que como resultado se forma a partir de los cromosomas después del final de la división nuclear. proceso complejo desenrollado (despiralización) de los cromosomas.

Al examinar la organización estructural de la cromatina y los cromosomas, definitivamente podemos hablar de varios niveles de compactación del ADN. El primero es nucleosomal, que proporciona una compactación siete veces mayor del ADN y la composición de las fibrillas de DNP, el segundo es una fibrilla con un diámetro de 30 nm, o nivel nucleomérico, con un grado de empaquetamiento de 40 a 70 veces, el tercero es de dominio. bucle, o cromomérico, que conduce a una compactación del ADN de 600 a 700 veces dentro de estas estructuras. Para mantener los dos primeros niveles de compactación, la participación únicamente de proteínas histonas fue suficiente, mientras que las estructuras de dominios en forma de bucle y roseta ya requerían la participación de proteínas no histonas y una transición del tipo de plegamiento del ADN helicoidal o solenoide al plegamiento del ADN. la formación de estructuras globulares compactas que consisten en bucles de fibrillas de cromatina con un diámetro de 30 nm, hasta estructuras como los cromómeros, que ya tienen dimensiones de 0,1-0,2 micrones.

Empaquetado de ADN en cromosomas.

La compacidad es una diferencia fundamental entre el genoma eucariota y el genoma procariótico. Con una diferencia promedio en los tamaños del genoma de 3 órdenes de magnitud, los tamaños lineales de los cromosomas eucariotas son comparables a la longitud del ADN procariótico.

Hay al menos 4 niveles de compactación del ADN. En este caso, la cadena de ADN se “acorta” 10.000 veces. Esto es similar a poner un hilo del largo de la Torre Ostankino (500 m) en una caja de cerillas (5 cm).

Los cromosomas de las células eucariotas se componen principalmente de cromatina, un complejo de ADN de doble cadena y cinco proteínas histonas, denominadas H1, H2A, H2B, H3 y H4.

Son las histonas las que proporcionan los dos primeros niveles de compactación del genoma eucariota: nucleosomal y nucleomérico.

Características generales de las histonas.

Las histonas son proteínas básicas. Todos ellos están enriquecidos con lisina y arginina, aminoácidos cargados positivamente. Dependiendo de la proporción de aminoácidos en la estructura de las histonas, generalmente se distinguen 5 fracciones de histonas. Se producen muchos de ellos: 60 millones de moléculas de cada fracción por célula.

Las modificaciones de las histonas influyen en gran medida en la compactación del ADN. Las histonas pueden estar metiladas, fosforiladas (en serina, treonina, tirosina), es decir. Los residuos de aminoácidos se modifican fácilmente. Además, es posible la alquilación y acetilación de histonas.

Principales fracciones de histonas:

Todas las histonas, excepto H1, son extremadamente conservadoras en términos evolutivos (¡en la vaca y el trébol, la diferencia en H2A es solo un aminoácido!). En consecuencia, estas proteínas desempeñan una función fundamental que se proporciona por igual en todos los eucariotas. Cualquier mutación en los genes de las histonas es letal.

H1 es una fracción muy variable. Esta histona difiere no sólo entre especies, sino incluso dentro de un mismo organismo, dependiendo de las etapas de la ontogénesis.

La lisina y la arginina están agrupadas en histonas. La parte media de la histona contiene aminoácidos hidrofóbicos. Los aminoácidos cargados positivamente de las histonas median interacciones electrostáticas con el ADN. La parte central es necesaria para la interacción de las histonas entre sí.

El papel de las histonas en el plegamiento del ADN es importante por las siguientes razones:

1) Si los cromosomas estuvieran formados únicamente por ADN estirado, es difícil imaginar cómo podrían replicarse y separarse en células hijas sin enredarse o romperse.

2) En estado extendido, la doble hélice del ADN de cada cromosoma humano cruzaría el núcleo celular miles de veces; Así, las histonas empaquetan una molécula de ADN muy larga de manera ordenada en un núcleo de varios micrómetros de diámetro;

3) No todo el ADN está plegado de la misma manera, y la forma en que una región del genoma está empaquetada en cromatina probablemente afecta la actividad de los genes contenidos en esa región.

Organización espacial del ADN.

SV razin

Serguéi Vladimirovich Razin, Miembro Correspondiente de la Academia de Ciencias de Rusia, Doctor en Ciencias Biológicas,
Jefe del Laboratorio de Organización Estructural y Funcional de los Cromosomas del Instituto de Biología Genética de la Academia de Ciencias de Rusia,
Profesor del Departamento de Biología Molecular, Facultad de Biología, Universidad Estatal M.V. Lomonosov de Moscú.

A principios del siglo pasado, gracias al uso de métodos puramente genéticos, quedó claro que los genes están ubicados linealmente en los cromosomas. Desde entonces, la mayoría de los investigadores han considerado el genoma como una cadena de genes y regiones intergénicas ubicados secuencialmente, incluidas varias secuencias reguladoras y otras (aparentemente insignificantes). Este estereotipo de pensamiento se refleja, en particular, en el hecho de que las distancias entre genes u otras secciones del ADN suelen indicarse en miles de pares de nucleótidos, es decir, las distancias a lo largo de la molécula de ADN.

Aunque esto es bastante correcto, esta idea de la linealidad del genoma encierra ciertos peligros. El hecho es que en el núcleo de una célula eucariota el genoma está empaquetado de forma extremadamente compleja. Como resultado, las secuencias de ADN, incluidos genes separados entre sí por decenas o cientos de miles de pares de nucleótidos y, a veces, incluso ubicados en diferentes cromosomas, terminan muy cerca en el espacio tridimensional. Esto asegura la interacción de complejos de proteínas asociados con elementos reguladores remotos (si contamos a lo largo de la molécula de ADN). Estas interacciones amplían significativamente las capacidades de varios sistemas reguladores en el genoma de una célula eucariota. EN últimos años Se obtuvieron varias observaciones fundamentalmente nuevas que aumentaron significativamente el interés en la organización espacial del ADN en el núcleo. Intentaremos resumir logros modernos en esta área.

Embalaje de ADN en el núcleo.

En una célula eucariota promedio, la longitud total del ADN genómico es de aproximadamente 2 m, el diámetro de su núcleo es de sólo ~10-20 μm. En este caso, el conjunto de genes que operan en una célula determinada debe ser accesible para las ARN polimerasas y los factores de transcripción, y todo el ADN de las células en división debe replicarse.

Hoy se sabe que el empaquetado del ADN en el núcleo de una célula eucariota se produce en varias etapas (Fig. 1). Primero, la cadena de ADN se pliega en nucleosomas y su longitud disminuye de seis a siete veces. A continuación, el filamento del nucleosoma se pliega formando la denominada fibrilla de 30 nm (filamento solenoide o en zigzag), que proporciona una compactación adicional de 40 veces. A continuación, la fibrilla se organiza en bucles grandes (50 mil o más pares de bases), cuyos extremos están unidos al esqueleto proteico del núcleo (a menudo se le llama matriz nuclear). En esta etapa, las dimensiones lineales del ADN se reducen 700 veces. También existen los siguientes niveles de compactación del ADN, cuya información actualmente es muy escasa y contradictoria.

Arroz. 1. Niveles de empaquetamiento del ADN en el núcleo de una célula eucariota.

Hasta ahora sólo hemos discutido el empaquetamiento de una molécula de ADN extendida. En una primera aproximación, esto puede considerarse el ADN de un cromosoma. Sin embargo, el genoma de una célula eucariota se divide en varios cromosomas. Por ejemplo, en las células del objeto favorito de los genetistas, la mosca de la fruta Drosophila, hay cuatro pares de cromosomas (en las células humanas, 46). Los cromosomas individuales sólo pueden verse bajo un microscopio durante la mitosis. Durante las fases restantes del ciclo celular, no son visibles y el núcleo celular parece relativamente homogéneo. Durante muchos años, los biólogos moleculares se han interesado por la cuestión de si los cromosomas individuales ocupan espacios limitados dentro del núcleo o, cuando los cromosomas se descompactan, el ADN de cada uno de ellos se distribuye por todo el núcleo, mezclándose inevitablemente con el ADN de otros cromosomas. .

Arroz. 2. Coloración de territorios cromosómicos.

A - ADN de cromosomas humanos en metafase. B - ADN del núcleo en interfase. B - ADN de los cromosomas en metafase ( azul) después de la hibridación con sondas cromosómicas específicas que reconocen el cromosoma 18 (rojo) y el cromosoma 19 ( verde); Se muestran dos homólogos del cromosoma correspondiente. D - resultados de la hibridación de ADN de núcleos en interfase con sondas cromosómicas específicas que reconocen los cromosomas 18 y 19. Se realizaron ocho secciones del núcleo utilizando un microscopio confocal; Todo el ADN nuclear está coloreado de azul (como en la Fig. B).

Hace unos 10 años se encontró la respuesta a esta pregunta. Los métodos de hibridación molecular permitieron teñir cromosomas individuales en el núcleo en interfase (Fig. 2). Resultó que, contrariamente al punto de vista generalmente aceptado en ese momento, ocupan espacios limitados que no se superponen dentro del núcleo (llamados "territorios cromosómicos", Fig. 3) y se ubican de manera no aleatoria: cromosomas ricos Los genes se localizan más cerca del centro del núcleo y los cromosomas pobres en genes, más cerca de su periferia. En el mantenimiento de posiciones específicas de territorios cromosómicos. papel importante juega la matriz nuclear.

Arroz. 3. bidimensional y modelos 3D Núcleos que muestran la ubicación de los territorios cromosómicos.

Interacción de elementos regulatorios remotos.

El empaquetado del ADN en estructuras jerárquicas de cromatina es de fundamental importancia para la distancia física entre las secuencias reguladoras y su orientación espacial. Y estas secuencias siempre sirven como sitios de unión para proteínas reguladoras. Ya la organización del ADN en nucleosomas puede hacer que estos sitios sean inaccesibles para los factores proteicos, u orientarlos de modo que los complejos proteicos colocados sobre ellos, por razones puramente estéricas (por ejemplo, dirigidos en direcciones opuestas), no puedan interactuar entre sí. Y con la formación de fibrillas aumentan las posibilidades de suprimir o activar determinados sistemas reguladores. Sin embargo, la disposición de los nucleosomas en el ADN es bastante dinámica. Los cambios reversibles en su estructura y el grado de condensación de la cromatina (en particular, la transición de un filamento nucleosomal desplegado a una fibrilla de 30 nm y estructuras heterocromáticas más compactas) constituyen la parte más estudiada de los mecanismos epigenéticos.

No discutiremos estos mecanismos, pero nos centraremos en el siguiente nivel de empaquetamiento del ADN en la cromatina, es decir, los bucles de ADN extendidos (Fig. 1). Pueden verse mediante microscopía electrónica de los cromosomas en metafase y los núcleos en interfase de los que se han eliminado las histonas. La presencia de bucles de ADN topológicamente cerrados en núcleos en interfase también se ha demostrado mediante métodos bioquímicos.

Los bucles de ADN adheridos a la matriz nuclear interesaron a los especialistas principalmente porque su tamaño podría corresponder a las unidades funcionales del genoma. Para comprobar esta suposición, fue necesario estudiar la especificidad de la organización del ADN en bucles. En primer lugar, establecer si la división del genoma en bucles es igual en todas las células. Si esta suposición es correcta, entonces algunos fragmentos del genoma siempre deberían ubicarse en las bases de los bucles de ADN, y otros, en los propios bucles. En segundo lugar, averiguar si existen algunas secuencias especiales de ADN encargadas de “anclar” los bucles en la matriz proteica del núcleo.

Método de corte del genoma

Durante los últimos 30 años, se han propuesto varios métodos para mapear los sitios de unión de los bucles de ADN a la matriz nuclear (columna vertebral cromosómica). Aunque estos métodos difieren en detalles, se pueden dividir en dos grupos fundamentalmente diferentes. El primero se basa en el aislamiento del llamado “ADN adyacente a la matriz nuclear” (es decir, ubicado en las bases de los bucles) y la fracción de bucles de ADN que se escinde de la matriz nuclear durante el procesamiento limitado de los núcleos. por la enzima nucleasa (Fig. 4). La presencia preferencial del fragmento de ADN en estudio en la fracción adyacente a la matriz nuclear, obtenida después de un tratamiento bastante intensivo con nucleasas, sugiere que está unido a la matriz nuclear. El segundo grupo de métodos tiene como objetivo estudiar la especificidad de las secuencias de ADN que interactúan con la matriz nuclear. Todos los métodos se basan en la unión selectiva. in vitro(es decir, in vitro) fragmentos de ADN clonado con una matriz nuclear aislada. Sin embargo, los resultados obtenidos utilizando dos enfoques metodológicos resultaron bastante contradictorios.

Arroz. 4. Esquema para establecer posiciones de genes en bucles de ADN.

A - nucleoide obtenido después de la extracción de histonas de núcleos no tratados con nucleasa; uno de los bucles de ADN contiene tres genes: "a" está ubicado en la parte proximal (en relación con la matriz nuclear) del bucle, "b" ocupa una posición intermedia y "c" está en la parte distal;
B - después del tratamiento de los núcleos con nucleasa, se forman aproximadamente dos roturas por bucle; Los fragmentos de ADN ubicados en las bases de los bucles (dentro del círculo de puntos) están unidos a la matriz nuclear. Tras la centrifugación diferencial, los fragmentos se separan y los genes “a” y “b” quedan en el ADN adheridos a la matriz nuclear;
B - después del tratamiento adicional con nucleasa, solo queda el gen "a".

Hemos observado que todos los métodos tienen como objetivo identificar y caracterizar fragmentos de ADN localizados en las bases de los bucles. Nuestro enfoque fundamentalmente nuevo se basa en cortar todo el genoma en bucles y luego caracterizarlos. A primera vista, dividir el genoma en bucles individuales resulta extremadamente difícil. Aquí es muy importante qué herramienta se utiliza para realizar roturas en las bases de los bucles de ADN. Afortunadamente, la propia naturaleza nos proporcionó esa herramienta. Los estudios han demostrado que uno de los componentes principales de la matriz nuclear es la enzima ADN topoisomerasa II, que regula la topología del ADN. Esta enzima introduce roturas de doble cadena en el ADN que, después de eliminar tensiones topológicas o separar catenanos, son suturadas (ligadas) por la misma enzima. Durante toda la reacción, la enzima, que consta de dos subunidades, permanece unida al ADN.

existe toda una serie Inhibidores de la ADN topoisomerasa II (en nuestro caso VM-26), que detienen la reacción en la etapa del complejo intermedio enzima-ADN. (Curiosamente, la mayoría de ellos se utilizan como agentes antitumorales). En este caso, cada una de las subunidades enzimáticas permanece asociada covalentemente con el extremo 5' de la cadena de ADN rota. Si dichos complejos bloqueados se tratan con un agente desnaturalizante y luego se destruyen con la enzima, se obtendrá una preparación de ADN cortada en fragmentos en los puntos de contacto entre el ADN y la enzima (Fig. 5). Si la topoisomerasa II estuviera localizada sólo en la matriz nuclear, entonces un simple tratamiento de células vivas con sus inhibidores cortaría todo el genoma en los sitios donde el ADN se une a la matriz nuclear. Sin embargo, la tarea se complica por el hecho de que esta enzima está presente en forma soluble en el nucleoplasma y puede introducir roturas en cualquier lugar (si se encuentra cerca del ADN en el momento en que las células son tratadas con el inhibidor). Los puntos de ruptura más probables serán las regiones libres de nucleosomas que son más sensibles a la ADN nucleasa (DNasa I). Para excluir la posibilidad de roturas fuera de las áreas de interés para la unión del ADN a la matriz nuclear, extrajimos la enzima soluble y, al mismo tiempo, las histonas, tratando los núcleos con NaCl 2 M (Fig. 4). Los denominados nucleoides resultantes se trataron con inhibidores de la ADN topoisomerasa II. De esta manera pudimos cortar todo el genoma en bucles individuales y sus oligómeros.

Arroz. 5. Esquema del método de mapeo de bucles de ADN:

A - reacción catalizada por la ADN topoisomerasa II y el mecanismo de corte del ADN cuando la actividad de reticulación de la enzima es inhibida por VM-26 y otros "venenos de topoisomerasa";
B - corte de ADN genómico en bucles individuales. Después de la eliminación de las histonas, los bucles de ADN desplegados todavía están unidos a la matriz nuclear (círculos amarillos) que contiene la ADN topoisomerasa II (círculos morados). Los nucleoides se incuban en medio VM-26 y luego se lisan con dodecilsulfato de sodio (SDS). En los sitios donde los bucles se unen a la matriz nuclear, la topoisomerasa II corta el ADN;
B: aparecen roturas en los bucles de ADN tratados con la enzima de restricción Sfi I. El fragmento Sfi I-Sfi I (mostrado en azul) puede identificarse mediante hibridación con una sonda complementaria a un extremo del fragmento de restricción de longitud completa (flecha azul). A la derecha está la misma región del genoma después de una ruptura adicional provocada por la topoisomerasa II (círculo violeta). El tamaño del fragmento acortado es igual a la distancia desde el sitio de escisión por la enzima de restricción del ADN Sfi I hasta el sitio de escisión por la topoisomerasa II;
D - imagen típica del resultado de la electroforesis. Un fragmento de ADN Sfi I-Sfi I de longitud completa es visible en todos los carriles. En las pistas que contienen ADN de nucleoides tratados con altas concentraciones de VM-26 aparece un fragmento adicional (Sfi I-Topo II), lo que indica que dentro del fragmento de ADN en estudio existe un sitio de unión a la matriz nuclear.

¿Qué hacer a continuación? ¿Cómo establecer las posiciones de los extremos de los bucles en el mapa físico del genoma? Recordemos que dicho mapa muestra las distancias reales a lo largo de la molécula de ADN entre ciertos marcadores. Los mapas físicos de varios genomas comenzaron a crearse mucho antes de que se descifraran los genomas de los humanos y de otros organismos. Los sitios de escisión del ADN por enzimas de restricción se suelen utilizar como marcadores al crear dichos mapas. Establecer la posición del sitio de unión del bucle de ADN a la matriz nuclear en mapa fisico- significa determinar la distancia desde el sitio de unión al sitio de escisión del ADN por una u otra enzima de restricción. Para ello, se puede utilizar el método de marcado indirecto de los extremos de fragmentos de ADN, propuesto hace unos 30 años para mapear las posiciones de los sitios de hipersensibilidad a la ADNasa I.

El principio de este método es que después de que uno u otro agente introduce roturas en el ADN (en nuestro caso, la ADN topoisomerasa II de la matriz nuclear), la preparación se corta adicionalmente con una enzima de restricción seleccionada. Después de separar los fragmentos mediante electroforesis y transferirlos a un filtro de nitrocelulosa, se lleva a cabo la hibridación con una muestra complementaria al extremo del fragmento extirpado, dentro del cual puede haber un espacio adicional. Si no existe tal brecha, después de la hibridación se obtendrá un fragmento de tamaño completo. Pero si el ADN dentro de este fragmento fue cortado por la topoisomerasa II de la matriz nuclear u otra enzima, el fragmento será más corto y su longitud será igual a la distancia desde el sitio de escisión del ADN por la enzima de restricción hasta el sitio de escisión del ADN. por el agente en estudio (Fig. 5). Cuando se trabaja con bucles cortados por la ADN topoisomerasa II, la principal dificultad es la necesidad de separar fragmentos de ADN muy largos por tamaño. Este problema puede resolverse mediante electroforesis de campo pulsado, que permite la separación de fragmentos de ADN cuyo tamaño varía entre varios miles y varios millones de pares de nucleótidos.

Mapa de la organización del dominio de bucle del gen de la distrofina humana

Hemos utilizado con éxito el método descrito anteriormente para mapear los límites de los bucles en varias regiones de los genomas humano y de Drosophila. Después de esto, se propuso una tarea a gran escala: construir un mapa de la organización en dominios de bucle del gen más largo conocido: el gen de la distrofina humana. Este gen, ubicado en el cromosoma X, tiene alrededor de 2500 mil pares de nucleótidos y el tamaño de su ARNm es de solo 14 mil pares de nucleótidos. En otras palabras, más del 99% de la longitud total del gen está ocupada por secuencias no codificantes (intrones). A menudo se producen varios reordenamientos en el gen de la distrofina, algunos de los cuales conducen a graves enfermedades hereditarias- distrofias musculares.

Arroz. 6. Mapa de la organización en bucle del gen de la distrofina humana.

Arriba- diagrama de la ubicación de los sitios y áreas de unión del ADN a la matriz nuclear (líneas horizontales designadas con los números 1-8) dentro de los límites del gen de la distrofina. Flechas verticales (latín letras A-I) indican la ubicación de los sitios de escisión; horizontal - en la posición de las muestras de hibridación.
Abajo- diagrama de visualización de fragmentos de ADN únicos en preparaciones de nucleoides. Después de extraer las histonas del núcleo, los bucles de ADN se enderezan y forman una corona alrededor de la matriz nuclear (a). Las preparaciones se hibridan con muestras que contienen biotina (línea gruesa en el diagrama b). Esta muestra se puede ver después de teñirla con anticuerpos unidos a un tinte fluorescente (círculos negros en el diagrama c).

Incluso antes de que se determinara la secuencia completa de nucleótidos del genoma humano, se construyó un mapa de la escisión del gen de la distrofina mediante la enzima de restricción SfiI. Mapeamos las posiciones de los sitios de unión del ADN a la matriz nuclear en relación con los puntos de escisión del ADN por esta enzima de restricción y encontramos que el gen de la distrofina tiene al menos nueve bucles separados por ocho zonas de unión. En algunos casos, la longitud de las secciones de ADN que separan dos bucles vecinos es comparable a la longitud de los propios bucles (Fig. 6, a). Esta observación fundamentalmente nueva hizo posible considerar las zonas de unión del ADN a la matriz nuclear como una parte especial del genoma. Es curioso que aquí es donde se encuentran los puntos críticos de recombinación previamente identificados en el gen de la distrofina. El patrón descubierto resultó ser válido para varios otros genes estudiados. Otra observación interesante (también confirmada en otros modelos experimentales) es que en las zonas de unión del bucle hay sitios desde donde comienza la replicación del ADN. Esto confirma la posición que formulamos hace 20 años sobre el principio más importante de organización del cromosoma eucariota: su construcción a partir de dominios estructurales y funcionales correspondientes a unidades de replicación.

Bucles de ADN bajo un microscopio

El enfoque experimental que utilizamos para mapear los bucles de ADN se basa en una serie de premisas lógicas que surgen del modelo de estructura cromosómica de bucle radial. Hasta hace poco, no había evidencia directa de que los bucles de ADN se mapearan usando diferentes metodos, exactamente los que se pueden ver en las preparaciones citológicas. Entre los muchos bucles entrelazados de ADN observados bajo microscopio electrónico, es casi imposible identificar el bucle como el fragmento genómico de interés para el investigador. Sin embargo, esto es posible cuando se analizan bucles a menor resolución.

Arroz. 7. Microfotografías de resultados de hibridación. in situ con preparaciones de halo nuclear (a) con un fragmento del genoma humano: un bucle de ADN asignado al gen de la distrofina. Este bucle está limitado a las regiones de unión a la matriz nuclear 7 y 8. Hibridación sin ADN competitivo (b) y en presencia de un exceso de fracción no marcada de secuencias repetidas de ADN humano (c).

Si observa los núcleos extraídos con NaCl 2 M en un microscopio fluorescente (después de teñir el ADN con uno u otro tinte fluorescente), puede ver una corona de bucles de ADN en forma de nube que rodea una zona central de color más brillante (matriz nuclear). ) (Fig. 7, a y diagramas en la Fig.6). Estas preparaciones se denominan halos nucleares, en los que los bucles individuales son indistinguibles. Para verlos es necesario utilizar el método de hibridación. in situ(en este caso, preparaciones de halos nucleares inmovilizados sobre vidrio) con el fragmento del genoma de interés. La muestra debe contener análogos de nucleótidos (por ejemplo, uridina biotinilada) que, después de la hibridación, se tiñen con tintes fluorescentes, como el rojo o el verde. Esto permite el análisis simultáneo de la distribución del ADN, que se tiñe más fácilmente con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) en color lila, y la distribución de la muestra después de la hibridación, coloreada de rojo o verde.

Durante la implementación del programa de secuenciación del genoma humano, se clonaron en diferentes laboratorios miles de fragmentos largos (de 100 a 300 mil pares de nucleótidos) de ADN humano. La mayoría de los clones fueron sistematizados según las posiciones de los fragmentos de ADN clonados en el genoma humano. Hay varios centros de investigación donde puedes adquirir el clon que te interesa. Tomamos un fragmento clonado de ADN humano, que representa el bucle de ADN que mapeamos en el gen de la distrofina, limitado por los sitios de unión 7 y 8 (ver Fig. 6). Después de la hibridación de este fragmento con preparaciones de halos nucleares, se detectan muchas señales distribuidas por todo el campo (Fig. 7, b). Esto se debe al hecho de que el ADN de los eucariotas superiores, incluidos los humanos, contiene muchas secuencias repetidas distribuidas por todo el genoma.

Las repeticiones presentes en nuestra muestra se hibridan con todas las secuencias complementarias. Está claro que los resultados de tal experimento no pueden interpretarse. Afortunadamente, se pueden suprimir las señales procedentes de la hibridación de secuencias repetidas. Para hacer esto, realizamos una hibridación en presencia de un exceso de la fracción no marcada de secuencias repetidas de ADN humano y vimos bucles de ADN unidos a la matriz nuclear (Fig. 7c). Todos tenían el mismo tamaño (dentro del error de medición), correspondiente a la longitud del fragmento de ADN mapeado en experimentos de corte de bucles de topoisomerasa II de ADN de matriz nuclear.

La importancia de este resultado va más allá de simplemente confirmar la exactitud de nuestro mapa de la organización del dominio del gen de la distrofina. Por primera vez en el mundo, hemos demostrado que un método bioquímico basado en el modelo radial de la estructura cromosómica permite mapear los bucles de ADN observados en preparaciones citológicas. Esto también confirma el modelo radial de la estructura cromosómica, a partir del cual se desarrolló nuestro método de corte de bucles. Además, la capacidad de observar bucles de ADN idénticos al analizar varias preparaciones de halos nucleares confirma el hecho de que el ADN está organizado estáticamente en bucles, es decir, En todas las células, los mismos fragmentos de ADN están unidos a la matriz nuclear y las áreas entre ellos forman bucles. Realizamos un experimento sobre células en división activa. Dado que se identifican bucles de ADN idénticos en todas las células, se puede argumentar que la organización específica del ADN en bucles separados por zonas de unión se mantiene a través de una serie de divisiones celulares. Esta circunstancia es sumamente importante, ya que nos permite considerar dicha organización del ADN como uno de los mecanismos epigenéticos. De hecho, durante la formación de bucles, las posiciones de varios elementos regulatorios y sus objetivos pueden fijarse, promoviendo su interacción o, por el contrario, excluyéndola.

Bucles de ADN, reordenamientos cromosómicos y evolución del genoma.

Como ya hemos comentado, los puntos calientes para la recombinación del gen de la distrofina se encuentran en segmentos adheridos a la matriz nuclear. Estudios adicionales han demostrado que los puntos calientes de recombinación también están unidos a la matriz nuclear y están presentes en varios otros genes, en particular aquellos cuyas recombinaciones están asociadas con el desarrollo de leucemia. Es difícil creer que esto fue sólo una coincidencia. Lo más probable es que sea el contacto constante del ADN con la topoisomerasa lo que provoque la aparición de "puntos calientes" de reordenamientos cromosómicos. La topoisomerasa II puede estar directamente involucrada en la recombinación ilegítima. Es aún más probable que las roturas de doble cadena que introduce en el ADN bajo ciertas condiciones puedan estimular una reparación imprecisa de estos daños.

Se sabe que la reparación de roturas de doble cadena en el ADN de eucariotas superiores a menudo conduce a diversos eventos de recombinación. El posible papel de la topoisomerasa II como inductor de reordenamientos cromosómicos está indicado por numerosos datos de que el uso de inhibidores de esta enzima en la quimioterapia tumoral provoca a menudo leucemia secundaria. Las células de estas leucemias se caracterizan por una variedad de cambios cromosómicos a gran escala, más comunes en los sitios de escisión del ADN topoisomerasa II. Es importante señalar que los sitios de unión de los bucles en la molécula de ADN están ubicados bastante lejos unos de otros, pero dentro del núcleo pueden estar muy próximos. La recombinación ilegal entre dichas regiones conducirá a la pérdida o desplazamiento de secciones extendidas del genoma, que, a su vez, pueden ser factor importante evolución del genoma.

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Las moléculas de ADN en los núcleos de las células eucariotas siempre están en complejo con proteínas como parte de la cromatina, que se forma a partir de los cromosomas después del final de la división nuclear como resultado del complejo proceso de desenrollado (despiralización) de los cromosomas.

Las proteínas representan aproximadamente el 60% del peso seco de la cromatina. Las proteínas en su composición son muy diversas. Suelen dividirse en dos grupos: histonas y proteínas no histonas. Son las histonas, características únicamente de las células eucariotas, las que llevan a cabo las primeras etapas del empaquetado del ADN, que son muy similares en la mayoría de los objetos estudiados.

Las histonas representan hasta el 80% de todas las proteínas de la cromatina. Su interacción con el ADN se produce debido a enlaces iónicos y no depende de la secuencia de nucleótidos de la molécula de ADN. Las histonas no son muy diversas. Se trata de proteínas globulares, representadas por 5-7 tipos de moléculas. Las clases de histonas más conocidas son: HI, H2A, H2B, NZ y H4. Sus principales propiedades están determinadas por el contenido relativamente alto de aminoácidos básicos: lisina y arginina (fig. 3.7). Las cargas positivas en los grupos amino de estos aminoácidos proporcionan una conexión electrostática de las histonas con cargas negativas en los grupos fosfato del ADN. De todas las proteínas nucleares, las histonas son las mejor estudiadas. Su peso molecular es relativamente pequeño (el máximo para las histonas NZ es 153 mil daltons). En casi todos los eucariotas tienen propiedades similares y se dividen en las mismas clases. De las estudiadas, estas proteínas son las más conservadoras: sus secuencias de aminoácidos son similares incluso en especies lejanas. La excepción es la histona HI, que se caracteriza por importantes variaciones entre especies y entre tejidos.

Durante la vida celular, las histonas pueden sufrir modificaciones postraduccionales, lo que cambia sus propiedades y su capacidad para unirse al ADN. Las histonas se sintetizan en el citoplasma, se transportan al núcleo y se unen al ADN durante su replicación en el período S del ciclo celular. Las histonas incorporadas a la cromatina son muy estables y tienen una baja tasa de recambio.

La presencia de histonas en todas las células eucariotas, su similitud incluso en especies muy distantes, su composición esencial en los cromosomas y la cromatina, todo esto indica el papel extremadamente importante de estas proteínas en la vida de las células. Un hito en el estudio del empaquetado del ADN en la cromatina fue el descubrimiento de los nucleosomas de partículas, en los que se produce la primera etapa del empaquetado del ADN en la cromatina. El núcleo del nucleosoma es siempre conservador y contiene ocho moléculas: dos moléculas de cada una de las histonas H4, H3, H2A, H2B. En la superficie del núcleo hay una sección de ADN de 146 pares de nucleótidos, que forman 1,75 vueltas alrededor del núcleo. Un pequeño trozo de ADN permanece libre del núcleo y se denomina conector (fig. 3.8). En diferentes objetos, la región enlazadora puede variar de 8 a 114 pares de nucleótidos por nucleosoma.

Se calcula que todo el genoma humano haploide (3 x 109 pares de bases) contiene 1,5 x 107 nucleosomas. Vista general La cromatina, representada por una molécula de ADN empaquetada mediante estructuras nucleosomales, puede compararse con cuentas en un hilo (fig. 3.9). Los nucleosomas son capaces de autoensamblarse cuando el ADN y las histonas están presentes en una determinada proporción en un tubo de ensayo. El primer nivel nucleosomal de compactación del ADN aumenta la densidad del empaquetamiento del ADN entre 6 y 7 veces.

En la siguiente etapa del empaquetamiento, la estructura de la cromatina nucleosomal está involucrada con la ayuda de la histona HI, que se une a la parte conectora del ADN y a la superficie del nucleosoma. Gracias a la compleja interacción de todos los componentes, surge una estructura ordenada en forma de espiral, que a menudo se denomina solenoide (Fig. 3.10). Aumenta la compacidad del ADN otras 40 veces. Dado que la estructura del solenoide tiene una capacidad reducida para unirse a proteínas que proporcionan la transcripción, se cree que este nivel de compactación del ADN puede desempeñar el papel de un factor de inactivación de genes. Algunos autores consideran la estructura del solenoide como una de opciones posibles embalaje de cromatina

con la ayuda de la histona HI y se cree probable la existencia de otras variantes morfológicas, por ejemplo, un nucleómero o una superperla (fig. 3.11).

Los niveles más altos de compactación del ADN en la cromatina están asociados con proteínas no histonas. Representan aproximadamente el 20% de todas las proteínas de la cromatina. Este grupo colectivo de proteínas se distingue por una amplia gama de propiedades y funciones. En total, la fracción de proteínas no histonas incluye alrededor de 450 proteínas individuales, cuyas propiedades y funciones específicas aún no se han estudiado suficientemente. Se descubrió que algunos de ellos se unen específicamente a ciertas secciones del ADN, como resultado de lo cual las fibrillas de cromatina forman bucles en los sitios donde el ADN se une a proteínas que no son histonas. Por lo tanto, los niveles más altos de empaquetamiento del ADN dentro de la cromatina no están garantizados por la espiralización de los hilos de cromatina, sino por la formación de una estructura de bucle transversal a lo largo del cromosoma (fig. 3.12). En todas estas etapas de compactación del ADN, la cromatina se presenta en forma activa, en él se produce la transcripción y síntesis de todo tipo de moléculas de ARN. Esta cromatina se llama eucromatina. Un mayor empaquetamiento de la cromatina conduce a su transición a un estado inactivo con la formación de heterocromatina.

Este proceso está asociado con la espiralización de grupos de bucles y la formación de estructuras en forma de rosetas a partir de fibrillas de cromatina, que tienen densidad óptica y electrónica y se denominan cromómeros (fig. 3.12). Se supone que a lo largo del cromosoma hay una gran cantidad de cromómeros conectados entre sí en una sola estructura mediante secciones de cromatina con empaquetamiento de ADN pucleosomal o solenoide. Cada par de cromosomas homólogos tiene su propio patrón cromomérico, que puede identificarse mediante métodos de tinción especiales, siempre que la cromatina esté siralizada y transformada a un estado cromosómico.

La estructura de bucle-roseta de la cromatina asegura no solo el empaquetamiento del ADN, sino que también organiza los cromosomas funcionales, ya que en sus bases los bucles de ADN están asociados con proteínas no histonas, que pueden incluir enzimas de replicación, que aseguran la duplicación del ADN, y enzimas de transcripción, debido a donde se produce la síntesis de todo tipo de ARN.

Las regiones de ADN empaquetadas en forma de heterocromatina pueden tener una naturaleza dual. Hay dos tipos de heterocromatina: facultativa y constitutiva (estructural). La heterocromatina facultativa representa regiones del genoma que están temporalmente inactivadas en determinadas células. Un ejemplo de dicha cromatina es la heterocromatina sexual del cromosoma X inactivado en las células somáticas de las mujeres. La heterocromatina estructural en todas las células está constantemente en estado inactivo y probablemente desempeña funciones estructurales o reguladoras.

Fin del trabajo -

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cromosomas- estructuras celulares que almacenan y transmiten información hereditaria. Un cromosoma está formado por ADN y proteínas. Un complejo de proteínas unidas al ADN forma la cromatina. Las proteínas desempeñan un papel importante en el empaquetamiento de las moléculas de ADN en el núcleo.

El ADN de los cromosomas está empaquetado de tal manera que cabe en el núcleo, cuyo diámetro no suele superar las 5 micras (5-10 - 4 cm). El envoltorio del ADN adquiere la apariencia de una estructura en bucle, similar a los cromosomas en cepillo de lámpara de los anfibios o los cromosomas politenos de los insectos. Los bucles son mantenidos por proteínas que reconocen secuencias de nucleótidos específicas y las unen. La estructura del cromosoma se ve mejor en la metafase de la mitosis.

El cromosoma es una estructura en forma de bastón y consta de dos cromátidas hermanas, que están sujetas por el centrómero en la región de la constricción primaria. Cada cromátida se construye a partir de bucles de cromatina. La cromatina no se replica. Sólo se replica el ADN.

El primer nivel de compactación del ADN es nucleosomal.. Si la cromatina se expone a nucleasas, ella y el ADN se descomponen en estructuras que se repiten regularmente. Después del tratamiento con nucleasa, se aísla de la cromatina mediante centrifugación una fracción de partículas con una velocidad de sedimentación de 11S. Las partículas 11S contienen alrededor de 200 pares de bases de ADN y ocho histonas. Esta partícula compleja de nucleoproteína se llama Nucleosomas. En él, las histonas forman un núcleo proteico, en cuya superficie se encuentra el ADN. El ADN forma una región que no está asociada con las proteínas centrales. Enlazador, Que, conectando dos nucleosomas vecinos, pasa al ADN del siguiente nucleosoma. Forman “cuentas”, formaciones globulares de unos 10 nm, asentadas una tras otra sobre moléculas de ADN alargadas. El segundo nivel de compactación es la fibrilla de 30 nm. PAG El primer nivel, nucleosomal, de compactación de la cromatina desempeña un papel regulador y estructural, asegurando una densidad de empaquetamiento del ADN entre 6 y 7 veces. En los cromosomas mitóticos y en los núcleos en interfase, se detectan fibrillas de cromatina con un diámetro de 25 a 30 nm. Se distingue un tipo solenoide de empaquetamiento de nucleosomas: un hilo de nucleosomas densamente empaquetados con un diámetro de 10 nm forma vueltas con un paso helicoidal de aproximadamente 10 nm. Hay de 6 a 7 nucleosomas por vuelta de dicha superhélice. Como resultado de dicho empaquetamiento, aparece una fibrilla en forma de espiral con una cavidad central. La cromatina en los núcleos tiene fibrillas de 25 nm, que consisten en glóbulos cercanos del mismo tamaño. Nucleómeros. Estos nucleómeros se denominan superperlas (“superperlas”). La fibrilla principal de cromatina con un diámetro de 25 nm es una alternancia lineal de nucleómeros a lo largo de una molécula de ADN compactada. Como parte del nucleómero, se forman dos vueltas de la fibrilla nucleosomal, con 4 nucleosomas en cada una. El nivel nucleomérico de empaquetamiento de cromatina asegura una compactación del ADN 40 veces mayor. Los niveles nuclesomales y nucleoméricos (superbid) de compactación del ADN de la cromatina son llevados a cabo por proteínas histonas. Dominios de bucle de ADN - tercer nivel organización estructural cromatina. En niveles más altos de organización de la cromatina, proteínas específicas se unen a secciones específicas de ADN, lo que forma grandes bucles o dominios en los sitios de unión. En algunos lugares hay grupos de cromatina condensada, formaciones en forma de rosetas que constan de muchos bucles de fibrillas de 30 nm que se conectan en un centro denso. El tamaño medio de las rosetas alcanza los 100-150 nm. Rosetas de fibrillas de cromatina - cromómeros. Cada cromómero consta de varios bucles que contienen nucleosomas y que están conectados en un solo centro. Los cromómeros están conectados entre sí por secciones de cromatina nucleosomal. Esta estructura de dominio de bucle de la cromatina asegura la compactación estructural de la cromatina y organiza las unidades funcionales de los cromosomas: replicones y genes transcritos.

Estructura cuaternaria del ADN. cromosomas

La estructura cuaternaria del ADN es la disposición de los nucleosomas en la cromatina, de modo que una molécula de ADN de varios centímetros de largo se pliega hasta 5 nm. La cromatina en preparaciones de células teñidas es una red de hebras delgadas (fibrillas), pequeños gránulos o grumos. La base de la cromatina está formada por nucleoproteínas, largas moléculas de ADN en forma de hilos (40%), conectadas a proteínas específicas, histonas (40%). Las histonas son una clase importante de nucleoproteínas, proteínas nucleares necesarias para el ensamblaje y empaquetamiento de las cadenas de ADN en los cromosomas. hay cinco varios tipos histonas: H1, H2A, H2B, H3, H4. Las histonas están enriquecidas con aminoácidos con radicales cargados positivamente (arginina, lisina) e hidrofóbicos (valina, etc.). Al mismo tiempo, gracias a los radicales arginina y lisina, las histonas interactúan con el ADN y, gracias a los radicales hidrófobos, entre sí. Las histonas desempeñan una importante función formadora de estructuras.

La cromatina también incluye ARN, proteínas ácidas (probablemente las proteínas ácidas también desempeñan un papel estructural, participando en la formación de niveles superiores, supranucleoméricos, de empaquetamiento cromosómico), lípidos y minerales (Ca²+ y Mg²+), así como la enzima ADN polimerasa. , que es necesario para la replicación del ADN. Durante la división nuclear, las nucleoproteínas giran en espiral, se acortan y, como resultado, se vuelven más densas y adquieren formas compactas en forma de bastón. cromosomas, que se vuelven perceptibles cuando se observan bajo un microscopio óptico. Un cromosoma es la forma más compacta del material hereditario de una célula (en comparación con una cadena de ADN, el acortamiento es aproximadamente 1600 veces). En la mayoría de los eucariotas, el ADN se enrolla hasta este punto sólo durante la división.

La estructura de los cromosomas. Cada cromosoma tiene una constricción primaria: un centrómero (una sección delgada, no espiralizada), que divide el cromosoma en dos brazos. En el área de la constricción primaria hay un cuerpo fibrilar, un cinetocoro, que regula el movimiento de los cromosomas durante la división celular: los hilos del huso están unidos a él, separando los cromosomas en los polos.

Arroz. 1. Estructura de un cromosoma: 1 – constricción primaria (cenromero); 2 – brazos cromosómicos; 3 – moléculas de ADN; 4 – telómeros

Dependiendo de la ubicación de la constricción, existen tres tipos principales de cromosomas:

1. Hombros iguales: con hombros de igual longitud;

2. Hombros desiguales: con hombros de longitud desigual;

3. Un solo hombro (en forma de varilla): con un hombro largo y el otro muy corto, apenas perceptible.

Arroz. 2. Principales tipos de cromosomas: 1 – cromosomas de brazos iguales; 2 – cromosomas desiguales; 3 – cromosomas de un solo brazo

La constricción secundaria es un organizador nucleolar, contiene genes de ARNr y está presente en uno o dos cromosomas del genoma. Esta región del cromosoma controla la síntesis del nucléolo.

Los telómeros son las secciones terminales de los cromosomas que contienen hasta 10 mil pares de nucleótidos con la secuencia repetida TTAGGG. Los telómeros no contienen genes, ellos:

Los extremos de los cromosomas están protegidos por la acción de las nucleasas, enzimas que destruyen el ADN.

·proporcionan unión de los extremos de los cromosomas desde el interior a la membrana nuclear.

· proteger los genes de la subreplicación terminal.

Cada célula de un tipo particular de organismo vivo se caracteriza por un cierto número, tamaño y forma de cromosomas. El conjunto de cromosomas de una célula somática, típico de un determinado grupo sistemático de hongos, animales o plantas, se denomina conjunto de cromosomas o cariotipo.

El número de cromosomas en las células germinales maduras se denomina conjunto haploide y se designa con la letra norte. Las células somáticas contienen un número doble de cromosomas (conjunto diploide), denotado como 2n. Las células que tienen más de dos juegos de cromosomas son poliploides (4n, 8n, etc.). Cromosomas pareados, es decir, idénticos en forma, estructura y tamaño, pero que tienen diferentes orígenes(uno materno, el otro paterno) se llaman homólogos.